DNA损伤/断裂分析试剂盒(IF FM HCS法)

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KFS341

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DNA损伤/断裂分析试剂盒(IF FM HCS法)

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产品规格：

100T

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1～3天

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本试剂盒通过高内涵分析可以对于同一细胞的健康参数、遗传毒性和细胞毒性进行同时定量分析。通过以磷酸化的H2AX(Ser139)抗体检测DNA损伤，可以对遗传毒性进行分析，进而反映DNA损伤情况。而细胞毒性的分析是通过试剂盒提供的死活细胞核染料进行染色区分鉴定的。

哺乳动物细胞中，双链断裂(DSB)的基因组DNA是一种潜在的致命病变。现已确知DSB的形成为导致H2A组蛋白的磷酸化。具体来说，在DNS双链断裂处形成DNA灶的过程中，DNA损伤诱导剂可以诱导组蛋白变体H2AX的在Ser139位点上的磷酸化。磷酸化的H2AX有利于募集蛋白质从而帮助DSB部位进行修复。在哺乳动物细胞中，磷脂酰肌醇3-激酶样蛋白激酶，如ATM，ATR、DNA-PKCs蛋白，以及磷酸化的组蛋白变体，H2AX。

染料参数

死细胞核染料SYTOX：Ex/Em=502/525，绿
Alexa Fluor 555：Ex/Em=555/565，橙
活细胞核染料Hoechst33342：Ex/Em=346/460，蓝

组分	规格
试剂A：死细胞核染料(绿，1mM in DMSO)	10μL
试剂B：pH2AX兔多克隆抗体(1mg/mL)	15μL
试剂C：Alexa Fluor 555羊抗兔IgG(2mg/mL)	10μL
试剂D：活细胞核染料(蓝，10mg/mL)	25μL

保存：-20℃，避光，有效期1年。

自备试剂

磷酸盐缓冲液(PBS)、细胞培养基、多聚甲醛16%水溶液、Triton X-100、牛血清白蛋白(BSA)

操作说明

染色液制备：
以下染液请在使用前新鲜配制，以下方法针对96孔板培养细胞设计。
1. 试剂A工作液(死细胞核染料)：将1.8μL的试剂A加入到6mL的完全细胞培养基中。
2. 制备固定液：1.5mL的16%多聚甲醛水溶液加入到4.5mL PBS中，得到4%的多聚甲醛固定液。
3. 制备促渗液：加15μL的Triton X-100到6mL的PBS中。
4. 制备封闭液：溶解0.25g的BSA到25mL的PBS中，混匀。
5. 试剂B工作液(一抗工作液)：加6μL的pH2AX抗体溶液(试剂B)到6mL的封闭液中。
6. 试剂C和D工作液(二抗/复染工作液)：加3μL的Alexa Fluor 555羊抗兔IgG(试剂C)和1μL的Hoechst33342(试剂D)
  到6mL的封闭液中。
关于96孔细胞培养板染色操作(以A549细胞为例)：
1. 处理细胞，保证细胞培养液的总体积在100μL。
  注：活细胞培养中DMSO浓度不要超过0.5%。
2. 细胞处理完毕后不要移去培养基。
3. 加入50μL的试剂A工作液，总体积为150μL，正常细胞培养条件孵育30分钟。
4. 移去培养基
5. 每孔加入100μL固定液，室温孵育15分钟。
6. 移去固定液，PBS洗涤一次。
7. 以100μL促渗液每孔，室温孵育细胞15分钟。
8. 移去促渗液，PBS洗涤一次。
9. 每孔加入100μL的封闭液，室温孵育60分钟，移去封闭液。
10. 加入50μL一抗工作液，室温孵育60分钟。
11. 移去一抗工作液，PBS洗涤三次。
12. 加入50μL的二抗/复染工作液，室温避光孵育60分钟。
13. 移去二抗/复染工作液，PBS洗涤三次。
14. 加入100μL的PBS每孔，上机分析。

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